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水中银鱼胚胎测试技术相关说明

1. 水中银鱼胚胎测试技术相关说明

  • 水中银的鱼胚胎测试实验室自2013年获得以ISO17025为标准的HKAS认证，该认证获100多个国家和经济体认可, 等同CNAS认证。
  • 水中银的科研团队拥有12年多的毒理学经验，其中首席技术官陈雪平博士是英国和欧盟注册毒理学家，皇家生物学会特许生物学家，公司拥有20多项发明专利且全部都成功转化为商业应用。
  • 水中银的科学顾问团队由来自美国、德国、瑞士、瑞典、比利时、日本、新加坡和中国香港等12位科学家组成。他们是毒理学范畴的领军人物，参与评选、制定及推广了多个国际标准，总共发布了2000多篇高影响学术论文。
  • 测试方法是参照OECD标准及相关标准建立，结果阐述和风险评估遵照WHO指引，由水中银科学家团队和科学顾问团共同完成。
    • 水中银的急性毒测试：参照OECD TG 236标准方法。OECD TG 236标准方法是应用斑马鱼胚胎测试化学品及物质（substance）的急性毒性，即半致死浓度。欧盟REACH根据OECD TG 236测试结果对化学品进行毒性分级。
    • 水中银的雌激素当量测试：是参照OECD TG 236，OCED TG 455和OECD 第34指引，遵循”有害结局路径”(Adverse Outcome Pathway) “毒理学风险评估概念所建立。测试结果参照国际粮农组织 / 世界卫生组织之食品添加物专家委员会（FAO/WHO JECFA）关于雌激素的安全指引，已及欧盟消费者安全科学委员会（SCCS）及食品安全局（ESFA）关于化妆品和食品安全风险评估指引进行分析评判。

 

2. 水中银鱼胚胎测试技术方法标准化进程

水中银的技术获得多个国内外政府部门与专家的认可，在进行一系列的方法标准化工作，包括深圳疾控中心已经在深圳立项的地方标准，中国毒理学会团标，广东省疾控中心的地方标准等。

 

3. 为何采用鱼胚胎测试技术？

根据联合国资料，我们被超过100,000种化学物质包围[1]。我们现有的法规所检测的理化物质则基于行业经验或重大安全事件发生以后的总结而列入标准，检测覆盖的化学物质具有局限性。根据世界卫生组织与联合国联合报导，这些可能出现在我们日用品的有害物质可以导致癌症、不育、性早熟、肥胖、神经系统紊乱等疾病[2]。很不幸的是，消费者没有足够的信息去做出正确的安全选择。

现有的法规主要依赖化学测试，化学测试精准，但在毒性评估应用上应该以生物学数据为基础的。而现有的生物学数据主要是针对纯化学品的，而现有的毒理学知识是难以评估化学品的混合物/鸡尾酒效应的。水中银的生物测试数据库显示，很多化学品在法规浓度范围内单独存在时毒性不显著，但多种混合在一起，其混合效应造成的毒性远高于我们的认知。我们的消费品正是由许多不同的化学品混合而成。因此，生物测试是更直接可靠的毒性测试方式。

当然，安全是个相对的概念。通过生物毒性测试不代表产品一定绝对安全；但毒性水平超出建议值的产品，从生物毒理学角度来讲，的确代表潜在生物风险相对更高。

急性毒测试结果演示：

雌激素当量测试结果演示：

生物测试可以反应产品的整体生物学数据。老鼠可以说是很多毒理测试的金标准。然而根据2017年Bioscience Reports报导 [3] ，根据Ensembl 2014科学资料[4] ，老鼠和人的总体基因相似度为75%，比斑马鱼（70%）只高5%（见图1）。由于饲养成本高而繁殖能力低等因素，限制了老鼠于高通量快销产品测试领域的应用。有见于此，水中银建立了全球领先的鱼胚胎生物测试平台。水中银的斑马鱼胚胎急性毒性测试会反应出产品的整体急性毒水平以及毒性特征如导致心脏水肿，骨骼畸形等，已经有很多科研资料证明鱼胚胎的这些反应和人类高度一致【6】。

而水中银的转基因鲭鳉鱼胚胎慢性毒测试则很明确测出的是类雌激素类物质，且换算成雌二醇当量值，参照世界卫生组织关于雌激素日摄取量指引可以直接产品的雌激素安全性进行评估。雌激素当量测试把样本的雌激素活性量化为当量值，起量化与风险评估思路和而二恶英类物质的检测及毒性当量值计算（TCDD）可以说是异曲同工。

 

图1.（摘自Bioscience Report 2017年的一篇文章[3]）

所有的毒性测试技术，应该都是本着帮助行业，帮助生产商把关和提升产品安全性能服务的。根据水中银的过往数据和经验，生物测试和化学分析可以很好的结合以对有毒成分进行有效溯源，说明改善和提升产品安全。

斑马鱼胚胎急性毒性测试的科学基础

  • 斑马鱼在基因[4]，器官组织[4]和生理上[5]和人类高度相似。
  • 斑马鱼胚胎测试早已成为美国FDA认可的药物毒性测试和功效评估方法[6]
  • 美国国立卫生研究院在2003年已经把斑马鱼评定为及大鼠和小鼠之后第三重要模式生物[6]
  • 斑马鱼胚胎测试已成为OECD标准方法来评估化学品及物质的急性毒水平[7]，欧盟化学品法规REACH则会根据该测试结果对测试物进行毒性分级[8].
  • 水中银的斑马鱼胚胎急性毒测试采用了OECD测试标准并进行优化。
  • 除此之外，斑马鱼的以下优点使其能够成为高通量快消产品毒性测试的最佳选择：
    • 斑马鱼个体小，成鱼大概 3 厘米——节省饲养和测试空间；
    • 斑马鱼体外受精，体外发育——不受母体影响，便于测试；
    • 斑马鱼胚胎时期不需要进食，依靠卵黄提供发展所需的能量——避免了喂食对测试造成的干扰；
    • 斑马鱼发育速度快，从受精卵到孵化变成小鱼只需要 3 天时间（其胚胎 1 天发育相当于人类胚胎的 12 周（约 4 个月）），到成鱼只需 3-4个月时间；
    • 斑马鱼胚胎通体透明，显微镜下各器官组织清晰可见——便于毒理反应观察；
    • 斑马鱼繁殖力强，一对斑马鱼一周可产 200-300 粒鱼卵——确保科学资料的统计正确性，且使得高通量测试成为可能。
    • 按照欧盟动物保护法[9] 鱼胚胎不属于动物，被国际科学家大力推荐用于替代动物测试。

 

转基因鲭鳉鱼胚胎雌激素当量测试（EEQ test）

水中银将一个获得诺贝尔奖的荧光蛋白基因转入到鲭鳉鱼胚胎中，对雌激素受体的一个下游基因choriogenin H进行了标记（这点从技术原理上避免了假阳性测试结果的出现），并经过超过10年时间将其稳定超过十代，测试的稳定性与准确性已经获得国际认可。

水中银独家拥有应用转基因鲭鳉鱼胚胎测试的专利技术，可以识别包括但不限于农药、兽药、抗生素、激素、塑化剂、有机持续污染物等在内的类雌激素化学物质。

这类化学物质（包括农药、兽药、抗生素、激素、塑化剂、有机持续污染物等）可以扰乱雌激素内分泌系统，已证实与癌症、不育、儿童性早熟、智商降低，神经系统紊乱、糖尿病有关。根据欧盟报导，这类污染物在欧盟造成的健康问题和不孕不育问题的医疗成本到达1630亿欧元每年[10]。

转基因鱼胚胎进行测试技术应用了OECD近年大力推崇的“有害结局路径”(Adverse Outcome Pathway, AOP)毒性评估策略[11]来测试类雌激素这一大类有害物质。其原理是基于类雌激素作用于生物体的毒理机制而建立的。目的是通过转基因标记技术来测量类雌激素目标基因表达量的变化来量化类雌激素的多少，参照粮农组织和世界卫生组织（FAO/WHO，2000）关于雌激素最高日摄取量[12]来评估测试物的安全性。

 

4. 鱼胚胎测试的特异性：

水中银的鱼胚胎生物测试和传统的化学分析之间不具备可比性。化学分析精准，但对于不在靶标范围的物质（未知有毒物质），或者不同物质间的“鸡尾酒效应”无法表现。而水中银的鱼胚胎测试则能有效反应样品的整体生物学毒性，特别是现有毒理学知识缺乏却非常重要的化学品混合效应。

基于现有文献报导和水中银团队10多年的研究积累，这里简单归纳了大众可能关注的且水中银鱼胚胎测试能够覆盖的有毒物质。本清单只是举例，没有覆盖到所有测试目标毒物。

 

雌激素当量测试（EEQ test）

可以量化的雌激素：乙二烯雌酚（Dienoestrol），己烷雌酚（hexoestrol），雌二醇（oestradiol）。（ppb水平）

  • 该测试覆盖所有具有雌激素活性的化学品，目标毒物包括但不限制于下列化学品：
  • 动物源雌激素类（如雌酮，雌二醇，雌三醇），（ppb）
  • 合成雌激素类（如炔雌醇（Ethinylstradiol），乙烯雌酚（Diethylstilbestrol），乙二烯雌酚（Dienoestrol），（ppb）
  • 防腐剂（如paraben类防腐剂），(ppm for mixtures)
  • 植物源雌激类素（如异黄酮，玉米赤霉烯醇，橙皮苷，苦参碱），（ppm）
  • 工业污染物（如双酚A，壬基酚，辛基酚），
  • 塑料原料（如塑化剂DEP, DPrP, DBP, DPeP, DHXP, BBP, DCHP, DEHP, DIOP, DOP, DINP等），（ppm for mixtures）
  • 某些农药和兽药（如甲氰菊酯、氰戊菊酯），（ppm）
  • 某些医药类化学品（如他莫昔芬，辛弗林），（ppm）
  • 化学防晒化学品（如BP-3等超过30种），(obvious mixture effect)
  • 某些色素（食品&化妆品添加剂）
  • 某些香精（食品&化妆品添加剂）

 

斑马鱼胚胎急性毒物测试（ATT Test)

已验证可测试超过1，000种有毒化学物质，目标毒物包括但不限制于下列化学品：

  • 农药：吡唑类（如芬普尼Fipronil，唑螨酯fenpyroximate等），酰胺类（如甲草胺alachlor, 甲霜林metalaxyl等），二甲酰亚胺类（如免克宁vinclozolin等），氨基甲酸酯类（如氯苯胺灵chlorpropham，抗蚜威pirimicarb等），有机磷类（如毒死蜱chlorpyrifos，二嗪磷Diazinon，杀虫畏tetrachlorvinphos，灭蚜蜱mecarbam等），苯基醚类（如喹氧灵quinoxyfen，），苯基脲类（异丙隆isoproturon，杀虫脲Triflumuron等），吡唑类（如唑螨酯fenpyroximate等），除虫菊酯类（如联苯菊酯bifenthrin，苄呋菊脂resmethrin等），嘧啶类（乙嘧酚磺酸酯bupirimate，氟苯嘧啶醇Nuarimol等），肟菌脂类（嘧菌酯Azoxystrobin等），磺酰胺类（如对甲抑菌灵tolylfluanid，氰霜唑cyazofamid等），敌菌灵类（阿托拉辛atrazin，莠灭净ametryn，去草凈terbutryn等）；三唑类（如唑triticonazole，双苯三唑醇bitertanol等），其它（如啶斑肟 pyrifenox，氟菌唑Triflumizole等），已知几百种不同类型的农药。（ppb-ppm级别不等）
  • 兽药：杀虫药（如氨丙啉amprolium, 氯苯胍robenidine），磺胺类药物（如磺胺吡啶sulfapyridine， 磺胺噻唑sulfathiazole，磺胺甲基恶唑sulfamethoxazole，磺胺甲恶唑sulfametoxazole等），氨苯砜dapsone, 西洛多辛sladoxin等），大环内酯类（如泰微素tylosin， 替米考星tilmicosin,），安定类（如普马嗪promazine, 卡拉洛尔carazolol, 阿扎呱隆azaperone，瘦肉精beta-agonists等），抗生素（如penicillin G，红霉素erythromycin，等）,荷尔蒙类（如乙烯雌酚Diethylstilbestrol），其它（如泰妙菌素tiamulin, 卡巴氧carbodox, 灰黄霉素griseofulvin，三氯仿trichlorfon，三唑仑Triazolam等）（ppb-ppm级别不等）
  • 防腐剂：如对羟基苯甲酸酯（如methyl paraben, ethyl paraben, isopropyl paraben, propyl paraben, isobutyl paraben, butyl paraben）类，硝酸盐类等。 （ppm 水平）
  • 抗氧化剂：如bencyl 4-hydrozybenzoate, 4-hexylresorcinol, propyl gallate, octyl gallate, nordihydrogauiaretic acid, thiabendazole, dehydro acetic acid等。（ppm 水平）
  • 塑化剂（如DEP, DPrP, DBP, DPeP, DHXP, BBP, DCHP, DEHP, DIOP, DOP, DINP等）（ppm 水平）
  • 三聚氰胺（melamine）（ppm水平）
  • 黄曲霉素（如aflatoxin M1, M2, B1, B2, G1 and G2）（ppb水平）
  • 食品添加剂（如色素，香精，防腐剂，乳化剂，抗氧化剂等）（ppm 水平）
  • 化妆品添加剂（如防腐剂，香精，色素，化学防晒剂，抗氧化剂，渗透增强剂，乳化剂，植物或动物提取成分等）（ppm 水平）

 

5. 鱼胚胎毒性测试和个别有毒物质剂量的不一致性（方法局限性）:

每种测试各有优缺点。

每种测试因侧重点不同，都有其优缺点，鱼胚胎测试也不例外。

鱼胚胎测试的最大优点是反映产品的整体生物学毒性，而不是单独某个有毒化学成分的毒性。斑马鱼胚胎急性毒测试对反应样本的整体急性毒水平在准确性和时间上都很有优势，雌激素当量测试对反应产品的整体雌激素活性上则有着快速，准确等优点。

然而这2个测试对于产品中分子量大于3000kDa的成分，以及非极性有机物不能为鱼胚胎所摄取，而不在测试范围内。且对含有某些大家非常关注却未必会对生物体造成急性毒或雌激素活性高的成分（如某些重金属 – 但重金属在大部分法规检测已经包含）的产品，鱼胚胎测试测试结果未必会和传统理化指标表现出明显的一致性。因为鱼胚胎测试的是整体生物学毒性，而法规关注的有毒物质未必是该产品的主要有毒物质，所以生物数据与理化数据相辅相成，相互补充。

以食用油为例，台湾2014年地沟油事件证明“劣质油”通过现有法规常用理化指标的测试，然而水中银的生物测试却发现“地沟油”具有显著的生物毒性，且后续研究发现毒性高的油品中含有会造成生物毒性的成分。水中银目前正和台湾食品工业研究所（FIRDI）、香港大学和卡罗琳医学院专家将相关研究成果于科学杂志发表，而该项目也获得香港创新科技署的大力资助（S/E035/15 ）。

这只是其中一个例子。我们有相关数据证明，如果水中银世界领先的生物技术被更大规模的采用，很多安全事件，包括三聚氰胺毒奶粉，毒鸡蛋，毒饺子，劣质油，塑化剂等，其实很有可能提前得到警示（鱼胚胎死亡或者发出强绿色荧光），有防患于未然的机会。

所以，鱼胚胎毒性数据是对于现行法规以理化数据为主的产品数据的有效补充，是消费者在选择更安全产品所需要的重要信息。

 

参考文献