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水中銀魚胚胎測試技術相關說明

1. 水中銀魚胚胎測試技術相關說明

  • 水中銀的魚胚胎測試實驗室自2013年獲得以ISO17025為標準的HKAS認證，該認證獲100多個國家和經濟體認可, 等同CNAS認證。
  • 水中銀的科研團隊擁有12年多的毒理學經驗，其中首席技術官陳雪平博士是英國和歐盟註冊毒理學家，皇家生物學會特許生物學家，公司擁有20多項發明專利且全部都成功轉化為商業應用。
  • 水中銀的科學顧問團隊由來自美國、德國、瑞士、瑞典、比利時、日本、新加坡和中國香港等12位科學家組成。他們是毒理學範疇的領軍人物，參與評選、制定及推廣了多個國際標準，總共發佈了2000多篇高影響學術論文。
  • 測試方法是參照OECD標準及相關標準建立，結果闡述和風險評估遵照WHO指引，由水中銀科學家團隊和科學顧問團共同完成。
    • 水中銀的急性毒測試：參照OECD TG 236標準方法。OECD TG 236標準方法是應用斑馬魚胚胎測試化學品及物質（substance）的急性毒性，即半致死濃度。歐盟REACH根據OECD TG 236測試結果對化學品進行毒性分級。
    • 水中銀的雌激素當量測試：是參照OECD TG 236，OCED TG 455和OECD 第34指引，遵循”有害結局路徑”(Adverse Outcome Pathway) “毒理學風險評估概念所建立。測試結果參照國際糧農組織 / 世界衛生組織之食品添加物專家委員會（FAO/WHO JECFA）關於雌激素的安全指引，已及歐盟消費者安全科學委員會（SCCS）及食品安全局（ESFA）關於化妝品和食品安全風險評估指引進行分析評判。

 

2. 水中銀魚胚胎測試技術方法標準化進程

水中銀的技術獲得多個國內外政府部門與專家的認可，在進行一系列的方法標準化工作，包括深圳疾控中心已經在深圳立項的地方標準，中國毒理學會團標，廣東省疾控中心的地方標準等。

 

3. 為何採用魚胚胎測試技術？

根據聯合國資料，我們被超過100,000種化學物質包圍[1]。我們現有的法規所檢測的理化物質則基於行業經驗或重大安全事件發生以後的總結而列入標準，檢測覆蓋的化學物質具有局限性。根據世界衛生組織與聯合國聯合報導，這些可能出現在我們日用品的有害物質可以導致癌症、不育、性早熟、肥胖、神經系統紊亂等疾病[2]。很不幸的是，消費者沒有足夠的資訊去做出正確的安全選擇。

現有的法規主要依賴化學測試，化學測試精准，但在毒性評估應用上應該以生物學資料為基礎的。而現有的生物學資料主要是針對純化學品的，而現有的毒理學知識是難以評估化學品的混合物/雞尾酒效應的。水中銀的生物測試資料庫顯示，很多化學品在法規濃度範圍內單獨存在時毒性不顯著，但多種混合在一起，其混合效應造成的毒性遠高於我們的認知。我們的消費品正是由許多不同的化學品混合而成。因此，生物測試是更直接可靠的毒性測試方式。

當然，安全是個相對的概念。通過生物毒性測試不代表產品一定絕對安全；但毒性水準超出建議值的產品，從生物毒理學角度來講，的確代表潛在生物風險相對更高。

急性毒測試結果演示：

 

雌激素當量測試結果演示：

生物測試可以反應產品的整體生物學資料。老鼠可以說是很多毒理測試的金標準。然而根據2017年Bioscience Reports報導 [3] ，根據Ensembl 2014科學資料[4] ，老鼠和人的總體基因相似度為75%，比斑馬魚（70%）只高5%（見圖1）。由於飼養成本高而繁殖能力低等因素，限制了老鼠于高通量快銷產品測試領域的應用。有見於此，水中銀建立了全球領先的魚胚胎生物測試平臺。水中銀的斑馬魚胚胎急性毒性測試會反應出產品的整體急性毒水準以及毒性特徵如導致心臟水腫，骨骼畸形等，已經有很多科研資料證明魚胚胎的這些反應和人類高度一致【6】。

而水中銀的轉基因鯖鱂魚胚胎慢性毒測試則很明確測出的是類雌激素類物質，且換算成雌二醇當量值，參照世界衛生組織關於雌激素日攝取量指引可以直接產品的雌激素安全性進行評估。雌激素當量測試把樣本的雌激素活性量化為當量值，起量化與風險評估思路和而二噁英類物質的檢測及毒性當量值計算（TCDD）可以說是異曲同工。

 

圖1.（摘自Bioscience Report 2017年的一篇文章[3]）

所有的毒性測試技術，應該都是本著幫助行業，幫助生產商把關和提升產品安全性能服務的。根據水中銀的過往資料和經驗，生物測試和化學分析可以很好的結合以對有毒成分進行有效溯源，説明改善和提升產品安全。

斑馬魚胚胎急性毒性測試的科學基礎

  • 斑馬魚在基因[4]，器官組織[4]和生理上[5]和人類高度相似。
  • 斑馬魚胚胎測試早已成為美國FDA認可的藥物毒性測試和功效評估方法[6]
  • 美國國立衛生研究院在2003年已經把斑馬魚評定為及大鼠和小鼠之後第三重要模式生物[6]
  • 斑馬魚胚胎測試已成為OECD標準方法來評估化學品及物質的急性毒水準[7]，歐盟化學品法規REACH則會根據該測試結果對測試物進行毒性分級[8].
  • 水中銀的斑馬魚胚胎急性毒測試採用了OECD測試標準並進行優化。
  • 除此之外，斑馬魚的以下優點使其能夠成為高通量快消產品毒性測試的最佳選擇：
    • 斑馬魚個體小，成魚大概 3 釐米——節省飼養和測試空間；
    • 斑馬魚體外受精，體外發育——不受母體影響，便於測試；
    • 斑馬魚胚胎時期不需要進食，依靠卵黃提供發展所需的能量——避免了餵食對測試造成的干擾；
    • 斑馬魚發育速度快，從受精卵到孵化變成小魚只需要 3 天時間（其胚胎 1 天發育相當於人類胚胎的 12 周（約 4 個月）），到成魚只需 3-4個月時間；
    • 斑馬魚胚胎通體透明，顯微鏡下各器官組織清晰可見——便於毒理反應觀察；
    • 斑馬魚繁殖力強，一對斑馬魚一周可產 200-300 粒魚卵——確保科學資料的統計正確性，且使得高通量測試成為可能。
    •  按照歐盟動物保護法[9] 魚胚胎不屬於動物，被國際科學家大力推薦用於替代動物測試。

 

轉基因鯖鱂魚胚胎雌激素當量測試（EEQ test）

水中銀將一個獲得諾貝爾獎的螢光蛋白基因轉入到鯖鱂魚胚胎中，對雌激素受體的一個下游基因choriogenin H進行了標記（這點從技術原理上避免了假陽性測試結果的出現），並經過超過10年時間將其穩定超過十代，測試的穩定性與準確性已經獲得國際認可。

水中銀獨家擁有應用轉基因鯖鱂魚胚胎測試的專利技術，可以識別包括但不限於農藥、獸藥、抗生素、激素、塑化劑、有機持續污染物等在內的類雌激素化學物質。

這類化學物質（包括農藥、獸藥、抗生素、激素、塑化劑、有機持續污染物等）可以擾亂雌激素內分泌系統，已證實與癌症、不育、兒童性早熟、智商降低，神經系統紊亂、糖尿病有關。根據歐盟報導，這類污染物在歐盟造成的健康問題和不孕不育問題的醫療成本到達1630億歐元每年[10]。

轉基因魚胚胎進行測試技術應用了OECD近年大力推崇的“有害結局路徑”(Adverse Outcome Pathway, AOP)毒性評估策略[11]來測試類雌激素這一大類有害物質。其原理是基於類雌激素作用於生物體的毒理機制而建立的。目的是通過轉基因標記技術來測量類雌激素目標基因表達量的變化來量化類雌激素的多少，參照糧農組織和世界衛生組織（FAO/WHO，2000）關於雌激素最高日攝取量[12]來評估測試物的安全性。

 

4. 魚胚胎測試的特異性：

水中銀的魚胚胎生物測試和傳統的化學分析之間不具備可比性。化學分析精准，但對於不在靶標範圍的物質（未知有毒物質），或者不同物質間的“雞尾酒效應”無法表現。而水中銀的魚胚胎測試則能有效反應樣品的整體生物學毒性，特別是現有毒理學知識缺乏卻非常重要的化學品混合效應。

基於現有文獻報導和水中銀團隊10多年的研究積累，這裡簡單歸納了大眾可能關注的且水中銀魚胚胎測試能夠覆蓋的有毒物質。本清單只是舉例，沒有覆蓋到所有測試目標毒物。

 

雌激素當量測試（EEQ test）

可以量化的雌激素：乙二烯雌酚（Dienoestrol），己烷雌酚（hexoestrol），雌二醇（oestradiol）。（ppb水準）

  • 該測試覆蓋所有具有雌激素活性的化學品，目標毒物包括但不限制於下列化學品：
  • 動物源雌激素類（如雌酮，雌二醇，雌三醇），（ppb）
  • 合成雌激素類（如炔雌醇（Ethinylstradiol），乙烯雌酚（Diethylstilbestrol），乙二烯雌酚（Dienoestrol），（ppb）
  • 防腐劑（如paraben類防腐劑），(ppm for mixtures)
  • 植物源雌激類素（如異黃酮，玉米赤黴烯醇，橙皮苷，苦參堿），（ppm）
  • 工業污染物（如雙酚A，壬基酚，辛基酚），
  • 塑膠原料（如塑化劑DEP, DPrP, DBP, DPeP, DHXP, BBP, DCHP, DEHP, DIOP, DOP, DINP等），（ppm for mixtures）
  • 某些農藥和獸藥（如甲氰菊酯、氰戊菊酯），（ppm）
  • 某些醫藥類化學品（如他莫昔芬，辛弗林），（ppm）
  • 化學防曬化學品（如BP-3等超過30種），(obvious mixture effect)
  • 某些色素（食品&化妝品添加劑）
  • 某些香精（食品&化妝品添加劑）

 

斑馬魚胚胎急性毒物測試（ATT Test)

已驗證可測試超過1，000種有毒化學物質，目標毒物包括但不限制於下列化學品：

  • 農藥：吡唑類（如芬普尼Fipronil，唑蟎酯fenpyroximate等），醯胺類（如甲草胺alachlor, 甲霜林metalaxyl等），二甲醯亞胺類（如免克寧vinclozolin等），氨基甲酸酯類（如氯苯胺靈chlorpropham，抗蚜威pirimicarb等），有機磷類（如毒死蜱chlorpyrifos，二嗪磷Diazinon，殺蟲畏tetrachlorvinphos，滅蚜蜱mecarbam等），苯基醚類（如喹氧靈quinoxyfen，），苯基脲類（異丙隆isoproturon，殺蟲脲Triflumuron等），吡唑類（如唑蟎酯fenpyroximate等），除蟲菊酯類（如聯苯菊酯bifenthrin，苄呋菊脂resmethrin等），嘧啶類（乙嘧酚磺酸酯bupirimate，氟苯嘧啶醇Nuarimol等），肟菌脂類（嘧菌酯Azoxystrobin等），磺醯胺類（如對甲抑菌靈tolylfluanid，氰霜唑cyazofamid等），敵菌靈類（阿托拉辛atrazin，莠滅淨ametryn，去草凈terbutryn等）；三唑類（如唑triticonazole，雙苯三唑醇bitertanol等），其它（如啶斑肟 pyrifenox，氟菌唑Triflumizole等），已知幾百種不同類型的農藥。（ppb-ppm級別不等）
  • 獸藥：殺蟲藥（如氨丙啉amprolium, 氯苯胍robenidine），磺胺類藥物（如磺胺吡啶sulfapyridine， 磺胺噻唑sulfathiazole，磺胺甲基噁唑sulfamethoxazole，磺胺甲噁唑sulfametoxazole等），氨苯碸dapsone, 西洛多辛sladoxin等），大環內酯類（如泰微素tylosin， 替米考星tilmicosin,），安定類（如普馬嗪promazine, 卡拉洛爾carazolol, 阿紮呱隆azaperone，瘦肉精beta-agonists等），抗生素（如penicillin G，紅黴素erythromycin，等）,荷爾蒙類（如乙烯雌酚Diethylstilbestrol），其它（如泰妙菌素tiamulin, 卡巴氧carbodox, 灰黃黴素griseofulvin，三氯仿trichlorfon，三唑侖Triazolam等）（ppb-ppm級別不等）
  • 防腐劑：如對羥基苯甲酸酯（如methyl paraben, ethyl paraben, isopropyl paraben, propyl paraben, isobutyl paraben, butyl paraben）類，硝酸鹽類等。 （ppm 水準）
  • 抗氧化劑：如bencyl 4-hydrozybenzoate, 4-hexylresorcinol, propyl gallate, octyl gallate, nordihydrogauiaretic acid, thiabendazole, dehydro acetic acid等。（ppm 水準）
  • 塑化劑（如DEP, DPrP, DBP, DPeP, DHXP, BBP, DCHP, DEHP, DIOP, DOP, DINP等）（ppm 水準）
  • 三聚氰胺（melamine）（ppm水準）
  • 黃麴黴素（如aflatoxin M1, M2, B1, B2, G1 and G2）（ppb水準）
  • 食品添加劑（如色素，香精，防腐劑，乳化劑，抗氧化劑等）（ppm 水準）
  • 化妝品添加劑（如防腐劑，香精，色素，化學防曬劑，抗氧化劑，滲透增強劑，乳化劑，植物或動物提取成分等）（ppm 水準）

 

5. 魚胚胎毒性測試和個別有毒物質劑量的不一致性（方法局限性）:

每種測試各有優缺點。

每種測試因側重點不同，都有其優缺點，魚胚胎測試也不例外。

魚胚胎測試的最大優點是反映產品的整體生物學毒性，而不是單獨某個有毒化學成分的毒性。斑馬魚胚胎急性毒測試對反應樣本的整體急性毒水準在準確性和時間上都很有優勢，雌激素當量測試對反應產品的整體雌激素活性上則有著快速，準確等優點。

然而這2個測試對於產品中分子量大於3000kDa的成分，以及非極性有機物不能為魚胚胎所攝取，而不在測試範圍內。且對含有某些大家非常關注卻未必會對生物體造成急性毒或雌激素活性高的成分（如某些重金屬 – 但重金屬在大部分法規檢測已經包含）的產品，魚胚胎測試測試結果未必會和傳統理化指標表現出明顯的一致性。因為魚胚胎測試的是整體生物學毒性，而法規關注的有毒物質未必是該產品的主要有毒物質，所以生物資料與理化資料相輔相成，相互補充。

以食用油為例，臺灣2014年地溝油事件證明“劣質油”通過現有法規常用理化指標的測試，然而水中銀的生物測試卻發現“地溝油”具有顯著的生物毒性，且後續研究發現毒性高的油品中含有會造成生物毒性的成分。水中銀目前正和臺灣食品工業研究所（FIRDI）、香港大學和卡洛琳醫學院專家將相關研究成果於科學雜誌發表，而該項目也獲得香港創新科技署的大力資助（S/E035/15 ）。

 這只是其中一個例子。我們有相關資料證明，如果水中銀世界領先的生物技術被更大規模的採用，很多安全事件，包括三聚氰胺毒奶粉，毒雞蛋，毒餃子，劣質油，塑化劑等，其實很有可能提前得到警示（魚胚胎死亡或者發出強綠色螢光），有防患於未然的機會。

所以，魚胚胎毒性資料是對於現行法規以理化資料為主的產品資料的有效補充，是消費者在選擇更安全產品所需要的重要資訊。

 

參考文獻